豬瘟病毒熒光RT-PCR檢測試劑盒

【產品名稱】
通用名稱：豬瘟病毒熒光RT-PCR檢測試劑盒
英文名稱：Diagnostic Kit for Classical Swine Fever Virus (RT-PCR Fluorescence Probing)
【預期用途】
本試劑盒主要用于檢測疑似感染豬血清及臨床病料中的豬瘟病毒（CSFV，Classical Swine Fever Virus），適用于CSFV的檢測、診斷和流行病學調查。

【檢測原理】
本試劑盒采用柱式法提取 RNA，并以之為模板，針對豬瘟病毒特有基因片段設計特異性引物和TaqMan熒光探針，采用一步法RT-PCR進行反轉錄擴增靶序列,在PCR擴增過程中監測熒光信號的變化，實現對豬瘟病毒的快速檢測。
【試劑盒組份】
1、試劑盒組成及貯藏條件

名稱	20份	貯藏條件
1、吸附柱	20個	冷藏 (A盒)
2、收集管	20個
3、裂解液	10 ml
4、洗液	2*10ml
5、洗脫液	500μL
6、陽性對照	50μL	-20℃ (B盒)
7、陰性對照	50μL
8、RT-PCR反應液A	120μL
9、RT-PCR反應液B	240μL

    2、有效期：6個月。
3、需自備材料：生理鹽水、組織研磨器、眼科剪、眼科鑷、無菌注射器、熒光PCR專用反應管、無酶1.5mL離心管和吸頭等。
4、適用儀器：ABI7000、ABI7300、ABI7500、ABI7900、MX3000P、MX3005P、iCycleriQ4、iCycleriQ5、MJ-chromo4、Light cycler R480、slan等全自動熒光定量PCR儀，具備檢測FAM的熒光通道即可。
【操作步驟】
    一、樣品制備
1、拭子樣品：用棉拭子沾取動物呼吸道分泌物或排泄物等,置于生理鹽水中攪拌,低溫保存送檢；
2、組織樣品：采集有明顯病變的淋巴結、脾臟、扁桃體、腎等組織樣品1.0g,眼科剪剪碎于組織勻漿器或研缽中充分勻漿或研磨，再加少量生理鹽水混勻，4℃條件下8000rpm，離心1min，取上清于滅菌的離心管中待檢。
    3、樣本要求：采樣量要足夠進行一次復檢，運輸、儲存過程確保低溫，盡量避免反復凍融，檢測前需充分解凍。
    二、病毒RNA的提取
    1、向無RNA酶的1.5ml EP管中分別加入樣品液200μL、裂解液 500μL，顛倒混勻，靜置2～3min；
    2、將液體轉入套有收集管的吸附柱中（取上清液避免堵塞柱子）,12000rpm離心1min；
    3、棄收集管液體，向吸附柱中加500μL洗液，12000rpm離心1min；
    4、重復步驟3；
    5、棄收集管液體，瞬離以徹底去除殘留液體；
    6、吸附柱轉入新的無酶EP管中，柱中央滴加20μL洗脫液，室溫靜置2min，12000rpm離心1min，EP管中液體即為RNA溶液；
    三、RT-PCR
    1、配液：取出RT-PCR反應液,在室溫融化后，瞬離，按照每份RT-PCR反應液A液5μL，RT-PCR反應液B液10μL的比例預混兩種反應液（操作過程要避光）,按15μL /管分裝到熒光專用PCR反應管中；
2、加樣RT-PCR：分別向分裝好的熒光專用PCR管中加入5μL樣本RNA或陰性對照或陽性對照，在熒光定量PCR儀上運行以下程序：
42℃ 30 min，95℃ 3 min；
然后進行94℃ 10 s，60℃ 30 s； 40個循環。
熒光通道選擇FAM，在每個循環的60℃時收集熒光信號。設置擴增體系為20μL，同時要選擇passive reference和quencher為none的模式。
【結果判定】
1、基線和閾值設定：基線調整取6-15個循環的熒光信號，閾值設定原則以閾值線剛好超過陰性對照檢測熒光曲線的最高點。
2、質量控制：反應結束后，陰性對照的檢測結果無特定的擴增曲線或Ct值為＞37或無；陽性對照的Ct值應≤30.0，且出現明顯的擴增曲線；否則實驗視為無效。
3、樣品判定：待檢樣品熒光信號有指數型增加，且結果顯示Ct值＜34.0，報告為陽性；Ct值＞37.0或無明顯擴增曲線時報告為陰性；34≤Ct值≤37時，復檢一次，重復結果為陽性者判定為陽性，否則判定為陰性。
【注意事項】
    1、實驗前請仔細閱讀本試劑盒說明書，嚴格按操作步驟執行；不使用本試劑盒提供的組分或不按照說明書進行實驗將可能導致錯誤結果。
    2、實驗室管理應嚴格按照國家有關臨床基因擴增實驗室的管理規范執行。實驗人員須為專業人員，實驗過程應分區進行，每個階段使用專用的儀器和設備；各區間人員流動及空氣流向應有嚴格要求；實驗用消耗品應有合理的清潔和質檢程序，避免環境或物品污染PCR殘留產物導致假陽性結果，避免核酸酶污染或擴增反應抑制物造成假陰性結果。
    3、所有病料相關容器應盡量潔凈、無菌、低溫條件保存；完成樣本核酸提取后，建議馬上進行下一步試驗，短期可保存于-20℃，長期應保存在-70℃。
    4、操作臺、移液器、離心機、耗材等儀器用品應經常用1.0%次氯酸鈉或稀鹽酸擦拭消毒或浸泡。實驗房間、超凈工作臺應定期或每次實驗后用紫外燈處理。
    5、所有試劑應在規定的溫度儲存，凍存試劑使用前應于室溫下完全融化，使用后立即放回-20℃。
    6、注意防止試劑盒組分受污染。試劑盒間成分勿混用，吸取液體時移液器吸頭盡量在液體表面層吸取。
    7、實驗產生的廢棄物應及時收集，遠離PCR實驗室才能進行無害化處理。